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【外泌體應用】天然納米藥物載體
發布時間： 2021-10-08 點擊次數： 3893次外泌體是來源于細胞內膜的30-180 nm的脂質雙層包裹的囊泡，包含有核酸、蛋白質和脂質等生命物質，在細胞外環境中循環，是細胞間通訊工具。外泌體在形成的過程中，會把一些蛋白質、活性酶囊括在內以及攜帶一系列的寡核苷酸，特別是線粒體DNA，mRNA，miRNA和許多其它非編碼RNA等。因而外泌體是天然的多功能載體，可以包裹并遞送各種生命物質，例如小RNA、mRNA和蛋白質等。相對于脂質體和病毒載體，外泌體穩定性高，生物相容性好，免疫原性低，而且可以滲透生物屏障（例如血腦屏障、胎盤屏障），故外泌體作為天然納米型藥物遞送載體有著巨大應用前景。
外泌體作為藥物載體的優勢
生物來源的外泌體作為載體，具備良好的生物相容性，生物可降解性，低毒性，穩定性以及低免疫原性。 首先，外泌體是納米級囊泡，具有穩定的磷脂雙分子層結構，可以裝載大量的水溶性物質。其次，外泌體表面有很多跨膜蛋白，在結構上還具有可改造性，通過基因修飾，實現體內靶向治療。此外，外泌體自身具有細胞選擇性與組織特異趨向性，可以通過血腦屏障和穿透致密結構組織。而且在治療上，外泌體載體還有易于注射和防止血管堵塞的特點。總而言之，天然的外泌體在藥物遞送和疾病治療有著巨大的潛力。
外泌體加載藥物的方式
1、外泌體直接加載藥物 電穿孔法是將藥物加載到外泌體中比較成熟的方法。電穿孔法的原理是將外泌體和藥物懸浮液暴露在電場中，外泌體膜上短暫的高壓脈沖下會產生無數的孔，藥物小分子則滲透到外泌體中。電穿孔方法簡單且省時，但高壓脈沖會使外泌體聚集，降低藥物加載效率。
除了電穿孔法外，還有其他方法將藥物加載到外泌體，如藥物和外泌體直接混合，超聲處理，轉染試劑等。超聲處理是一種應用超聲波將藥物加載入外泌體的方法，具有高載藥效率和持續藥物釋放的優點。
2、外泌體分泌前加載藥物 藥物與細胞一起孵育的方式，可以將藥物通過分泌外泌體釋放到培養基。即先將藥物載入到源細胞中，通過分離純化獲得載藥外泌體。另外還有比較常用的一種方法是轉染，即將小分子RNA轉染至源細胞。
間充質干細胞（MSCs）因其在腫瘤微環境中的定位能力而被應用于輸送抗癌藥物。Pascucci等發現經紫杉醇（PTX）誘導后，骨髓MSCs分泌的外泌體載有紫杉醇，通過超速離心將外泌體分離出來，研究其對人胰腺癌細胞株的影響，結果表明負載紫杉醇的MSCs分泌的外泌體含大量紫杉醇，具有較強的抗腫瘤活性。
外泌體遞送的藥物類型
外泌體最大的特性之一是它們穿過屏障（如細胞質膜和血腦屏障）的能力，作為藥物遞送載體具有很大潛力，適用于遞送各種化學物質、蛋白質、核酸和基因治療劑。
1、外泌體作為小分子藥物遞送載體 腫瘤治療需要低免疫原性和低毒性的靶向藥物載體。2013年Tian等發表在Biomaterials的文章通過電穿孔將化療藥物如阿霉素（Dox）加載到iRGD肽功能化的外泌體，輸送到BALB/c裸鼠的腫瘤組織中。為了降低免疫原性和毒性，使用小鼠未成熟樹突狀細胞（IMDC）產生外泌體。通過工程化IMDC以表達與αv整合素特異性iRGD肽融合的外泌體膜蛋白（Lamp2b），具有腫瘤靶向性。從IMDC純化的外泌體通過電穿孔加載Dox，加載率高達20%。靜脈注射靶向性外泌體將Dox特異性地輸送到腫瘤組織，抑制腫瘤生長而無明顯毒性。
熒光共聚焦成像，iRGD-Exos在細胞內遞送Dox藥物
2、外泌體作為CRISPR-Cas9質粒的載體 CRISPR/Cas9是一種很有前途的基因編輯技術。迄今為止，CRISPR/Cas9的細胞內運載體受到免疫原性、運載容量和低耐受性等問題的限制。McAndrews等在今年的Life Sci Alliance期刊發表文章，報告了一種基于工程外泌體的CRISPR/Cas9非病毒遞送系統。
文章表明，非自體外泌體可以通過常用的轉染試劑包封CRISPR/Cas9質粒DNA，并且可以運送到受體癌細胞以誘導靶向基因缺失。在胰腺癌的原位模型中，裝載CRISPR/Cas9的外泌體可以靶向胰腺癌細胞中的突變Kras G12D致癌等位基因，從而抑制癌細胞增殖和生長。外泌體是CRISPR/Cas9基因編輯靶向治療的一個潛在遞送系統。
3、外泌體作為核酸藥物遞送載體
外泌體包含miRNA、siRNA、mRNA等，說明外泌體具有對核酸藥物的天然包容性。外泌體可以攜帶遺傳基因（例如miRNA，siRNA）到靶細胞中，從而在生物學和致病過程中誘導遺傳修飾。外泌體的這種特征受到了基因治療的青睞。
2011年Alvarez-Erviti等發表在Nat Biotechnol上文章，研究外泌體將siRNA遞送到小鼠大腦。為了降低免疫原性，作者使用自體樹突狀細胞分泌的外泌體，通過樹突狀細胞表達外泌體膜蛋白Lamp2b，融合到神經元特異性RVG肽，實現了靶向。利用電穿孔法將純化的外泌體加載外源性siRNA。靜脈注射靶向外泌體將siRNA特異性傳遞給大腦中的神經元、小膠質細胞。
結果表明，在治療阿爾茨海默病的小鼠模型中，外泌體可以作為siRNA向大腦遞送的有效載體。
靶向外泌體基因遞送的給藥示意圖
Naseri等利用從骨髓間充質干細胞中分離的外泌體（MSCs-Exo）來遞送LNA（locked nucleic acid）修飾的抗miR-142-3p寡核苷酸，以抑制4T1和TUBO乳腺癌細胞系中miR-142-3p和miR-150的表達水平。體外實驗結果表明，MSCs-Exo能有效地遞送抗miR-142-3p，降低miR-142-3p和miR-150水平。作者還評估了MSCs-Exo在荷瘤小鼠體內的分布。體內實驗結果表明，MSCs-Exo可以穿透腫瘤部位，將抑制性寡核苷酸導入腫瘤組織，從而下調miR-142-3p和miR-150的表達水平。MSCs來源外泌體可以作為可行的納米載體遞送RNA藥物分子。
MSCs-Exo在荷瘤小鼠體內的分布
4、外泌體作為蛋白質的藥物遞送載體
蛋白質藥物相對于基因藥物更直接，但是直接進入生物體內的蛋白質藥物容易引起免疫反應而被清除。已經發現外泌體可遞送多種蛋白質，如酶、細胞骨架蛋白質和跨膜蛋白質等。
Yim等2016年發表文章使用光誘導外泌體加載治療蛋白，使用藍光控制可逆的蛋白-蛋白相互作用模型和內源性外泌體發生過程，將蛋白質裝載到外泌體中。該研究小組將蛋白治療劑與感光色素蛋白2（CRY2）相結合，外泌體與螺旋-環-螺旋（CIBN）相結合，然后用450~490 nm波長的藍光照射，此時蛋白質治療劑和外泌體將會結合在一起。結果表明，該技術可誘導蛋白質治療劑到達靶細胞，是一種高效的外源蛋白質裝載方法，可以作為一種有效的將蛋白治療藥物載入到受體細胞和組織的方法。
藍光控制可逆的蛋白-蛋白相互作用模型和內源性外泌體發生過程示意圖
Nature Biotechnology雜志去年發表文章，報道了多家大型制藥公司如禮來、武田、拜耳等押注外泌體和其他細胞外囊泡，作為治療藥物遞送的一種手段。Aruna Bio公司于2019年7月完成1300萬美元的融資，用于支持神經外泌體遞送平臺的持續開發和新型神經外泌體療法的推進。總部位于英國牛津的 Evox Therapeutics 于2017年12月宣布與勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）進行合作，研究外泌體介導與RNAs藥物遞送，并于2018年9月獲得3550萬英鎊的B輪融資。
盡管外泌體作為藥物載體是一個熱門研究方向，但現階段還有技術問題有待解決。其一是大規模高效生產（【外泌體研究】FiberCell為您富集高濃度的外泌體），還有就是外泌體的純化純化技術，對于大規模外泌體的純化目前還沒有很好的解決方案，這是目前外泌體應用上所面臨的重大挑戰。
參考文獻： Pascucci L, Coccè V, Bonomi A, et al. Paclitaxel is incorporated by mesenchymal stromal cells and released in exosomes that inhibit in vitro tumor growth: a new approach for drug delivery. J Control Release. 2014;192:262-270.
Tian Y, Li S, Song J, et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 2014;35(7):2383-2390.
McAndrews KM, Xiao F, Chronopoulos A, et al. Exosome-mediated delivery of CRISPR/Cas9 for targeting of oncogenic KrasG12D in pancreatic cancer. Life Sci Alliance. 2021;4(9):e202000875.
Alvarez-Erviti L, Seow Y, Yin H,et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol. 2011;29(4):341-345.
Naseri Z, Oskuee RK, Jaafari MR, Forouzandeh Moghadam M. Exosome-mediated delivery of functionally active miRNA-142-3p inhibitor reduces tumorigenicity of breast cancer in vitro and in vivo. Int J Nanomedicine. 2018;13:7727-7747.
Yim N, Ryu SW, Choi K, et al. Exosome engineering for efficient intracellular delivery of soluble proteins using optically reversible protein-protein interaction module. Nat Commun. 2016;7:12277.
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