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    核酸提取的方法

    發布時間: 2021-10-22  點擊次數: 1659次

    核酸是遺傳信息的載體,是最重要的生物信息分子,是分子生物學研究的主要對象,因此核酸的提取是分子生物學實驗技術中最重要、最基本的操作。

    核酸提取系列目錄

    一、DNA提取方法簡介

    二、DNA提取常見問題、原因分析及其對策

    三、RNA提取方法簡介

    四、RNA提取及其RT-PCR常見問題、原因分析及其對策



    一、DNA提取方法簡介

    1基因組DNA的提取

    1.1CTAB

    1.2SDS

    1.3其它

    2非基因組DNA的提取

    2.1、質粒DNA的提取

    2.1.1、堿裂解法

    2.1.2煮沸法

    2.2線粒體、葉綠體DNA的提取

    差速離心結合SDS裂解法

    1、基因組DNA的提取

    1.1、CTAB

    CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三呷基溴化銨),是一種陽離子去污劑,可溶解細胞膜,并與核酸形成復合物。

    具有從低離子強度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性,在這種條件下,蛋白質和中性多聚糖仍留在溶液里。

    該復合物在高鹽溶液中(>0.7mol/L NaCl)是可溶的,通過有機溶劑抽提,去除蛋白、多糖、酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。

    注:CTAB溶液在低于15℃ 時會形成沉淀析出,因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預熱,且離心時溫度不要低于15℃。


    CTAB提取緩沖液的經典配方

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    Tris-HCl pH8.0)提供一個緩沖環境,防止核酸被破壞;
    EDTA螯合Mg2+Mn2+離子,抑制DNase活性;
    NaCl 提供一個高鹽環境,使DNP(脫氧核糖核蛋白 );
    CTAB溶解細胞膜,并結合核酸,使核酸便于分離;
    β-巰基乙醇是抗氧化劑,有效地防止酚氧化成醌,避免褐變,使酚容易去除。

    CTAB提取緩沖液的改進配方
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    PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡合物,能與多酚形成一種不溶的絡合物質,有效去除多酚,減少DNA中酚的污染;同時它也能和多糖結合,有效去除多糖。

    PVP(聚乙烯吡咯烷酮)
    PVP 按其平均分子量大小分為四級,習慣上常以K值表示,不同的K值分別代表相應的PVP平均分子量范圍。K值實際上是與PVP水溶液的相對粘度有關的特征值,而粘度又是與高聚物分子量有關的物理量,因此可以用K值來表征PVP的平均分子量。通常K值越大,其粘度越大,粘接性越強。
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    在研磨過程中加入PVP,其中的CO-N=基有很強的結合多酚的能力,從源頭上減少了酚類被氧化的機會。
    同時向抽提液中加入還原劑β-巰基乙醇,后者能打斷多酚氧化酶中的二硫鍵,使多酚不易被氧化,隨后經抽提而去除。

    CTAB法流程圖
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