步驟

1. 準(zhǔn)備下列試劑和材料：

60 mm MEF 滋養(yǎng)板（接種不能超過(guò) 7 天）

帶棉塞無(wú)菌巴斯德吸管

無(wú) Ca2+ 和 Mg2+ PBS

ES 生長(zhǎng)培養(yǎng)基

胰酶溶液

2. PBS 沖洗 ES 細(xì)胞，巴斯德吸管加胰酶溶液覆蓋培養(yǎng)皿底（2 ml/p60）

3. 37℃ 孵育 5 分鐘左右，至細(xì)胞脫落。

4. 巴斯德吸管輕輕吹吸胰酶處理細(xì)胞 4~6 次，分散 ES 細(xì)胞。分散的細(xì)胞，包括單細(xì)胞和小的細(xì)胞團(tuán)，轉(zhuǎn)移至裝有 2 ml 預(yù)熱（37℃）ES 生長(zhǎng)培養(yǎng)基的 15 ml 離心管。

5. 離心收集細(xì)胞。吸掉上清，留約兩倍于細(xì)胞沉淀的體積。輕彈離心管懸浮細(xì)胞。加 10 ml ES 生長(zhǎng)培養(yǎng)基，吹吸至懸液均勻。

6. 計(jì)數(shù)細(xì)胞。由于 ES 細(xì)胞較 MEF 細(xì)胞小，呈圓形，二者很容易區(qū)分。

7. ES 細(xì)胞接種 60 mm MEF 滋養(yǎng)板。吸掉 MEF 滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基，加入懸于 5 ml ES 生長(zhǎng)培養(yǎng)基的 ES 細(xì)胞。

8. 每天換一次液，加 5 ml ES 生長(zhǎng)培養(yǎng)基。